實驗前:
1.對實驗器皿的準備:對玻璃器皿進行清洗,將洗凈干燥的平皿、乳缽、刻度吸管等用牛皮紙包裹,放入鼓風干燥箱中于160℃干熱滅菌2小時或放入高壓蒸汽滅菌柜于121℃濕熱滅菌30分鐘,備用。
2.對實驗用培養基及稀釋液的準備:按規定比例配制實驗所需的各種培養基及稀釋液,包好,放入高壓蒸汽滅菌柜于121℃濕熱滅菌30分鐘,備用。
3.潔凈服的準備:將當天實驗所用潔凈服放入高壓蒸汽滅菌柜于121℃濕熱滅菌30分鐘,備用。
實驗中:
1.將實驗所需器皿、培養基、潔凈服、樣品、稀釋液放入相應的傳遞窗中,打開紫外燈,照射30分鐘。
2.打開潔凈室的通風設備1小時以上,觀察潔凈室各個規定區域的壓差是否符合相應規定范圍,若不符合,則應通知設備部門及時進行調整。
3.進入潔凈室,換上工作鞋,用洗手液洗手,烘干,換上潔凈服,戴上口罩、手套,并與噴手器下用75%乙醇或0.1%新潔爾滅對雙手進行消毒。
4.進入萬級潔凈走廊,觀察各個規定房間的溫度、濕度、壓差是否符合規定,并與傳遞窗中將經紫外燈照射后的樣品、器皿稀釋液及培養基,放入相應的實驗室(如微生物限度檢查室或無菌檢查室)。并將培養基的溫度控制在45℃以下(若培養基出現凝固現象時,因微波爐加熱融化;若溫度太高時,則應用純化水降溫至不燙手背宜。
5.打開超凈工作臺的紫外燈,照射30分鐘,然后再打開超凈工作臺的通風設備。用75%乙醇或0.1%新潔爾滅對實驗所用工作臺面進行擦拭消毒(消毒時應遵循由里到外,由上到下,由潔凈要求高到潔凈要求低的原則)。
6.按照適宜的次序于超凈工作臺內擺放好稀釋液、天平、消毒液、集菌儀、剪刀、鑷子等物品,用75%酒精棉球進行消毒,將樣品內包裝表面用碘酒棉球以及75%酒精棉球依次進行消毒。將營養瓊脂平板與超凈工作臺的左、中、右各置一個(平板需經下預培養48小時且無菌生長),開蓋暴露30min,測定的沉降菌每平板不得超過1cfu,則符合百級超凈工作臺的沉降菌標準(注:在潔凈工作臺進行操作時,為防止污染,應用酒精棉球對雙手反復消毒)。
7.樣品處理(以采用離心薄膜過濾法為例): 用天平稱取規定量的樣品,置于乳缽中,碾碎,少量幾次加入規定量(用滅好菌的兩頭高量取)的稀釋液,研磨均勻,以制備供試液。8.細菌的檢查:用滅菌吸管吸取規定量的供試液于離心管中,500轉/秒,離心3分鐘。離心后用注射器吸取規定量的上清液于集菌儀中(集菌儀中的濾膜應事先用少量的蛋白胨溶液進行潤洗),再用規定量的蛋白胨溶液進行反復沖洗(每次沖洗量不得超過100ml,每張濾膜的總的沖洗量不得超過1000ml,且沖洗過程中應該保持濾膜的完整性)。并用等量的蛋白胨溶液制備陰性對照的濾膜。
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